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细胞骨架染色试剂盒采用丝状肌动蛋白F-actin荧光染色法染色细胞骨架，可以用于各种动物、植物的细胞骨架染色。
本试剂盒采用荧光探针C15标记的鬼笔环肽(Phalloidin)标记骨架蛋白F-actin。C15为红色荧光探针，也可提供绿色和蓝色的C11和C13标记试剂盒。可以满足您完整的F-Actin微丝蛋白荧光染色方案，为您提供极大的选择空间和便利。
细胞骨架是真核细胞中由蛋白质聚合而成的三维的纤维状网架体系。包括微丝、微管和中间纤维。在维持细胞形态，承受外力、保持细胞内部结构的有序性方面起重要作用。细胞骨架肌动蛋白是球形的、大约42kd的蛋白，在几乎所有的真核细胞都存在。这是一个非常保守的蛋白，在各物种差异不超过20%。肌动蛋白是两种细胞内丝状结构的构成单体：微丝，以及细肌丝。肌动蛋白参与很多重要的细胞功能，包括肌肉收缩，细胞移动，细胞分裂和胞质分裂、小泡和细胞器的运动、细胞信号，以及细胞连接和细胞形态的保持和建立。
显示细胞骨架的常用方法有两种：骨架蛋白染色法和免疫荧光染色法。骨架蛋白染色法具有简单易行的特点，但不能区分骨架蛋白的组成，有些类型的纤维太细，在光学显微镜下无法分辨，常用于骨架形态及完整性研究；免疫荧光染色法可特异显示骨架蛋白，是用一种微丝解聚抑制剂，它与肌动蛋白纤丝有强亲和作用，使肌动蛋白纤丝稳定，抑制解聚，且只与F-actin结合.因此，利用荧光标记可以清晰显示细胞中微丝的形态，利用荧光显微镜对荧光标记的细胞骨架进行观察，可以得到清晰的实验结果.具有更普遍的应用意义。
没有荧光观察条件，需要常规骨架蛋白染色试剂盒，可以选择我公司货号为HR8337的试剂盒。
C15-Phalloidin染色反应特异性强，对比性高，具有比Actin抗体更好的染色效果，适合用作F-actin的定性和定量检测。另外，经本品结合后的F-actin仍能维持actin自身具有的许多生物学特性。且本品的结合没有物种差异性，适用性广泛。C15-Phalloidin可以广泛用于固定、通透性细胞，但也可进入活细胞中。
试剂盒以外自备仪器和试剂耗材：
● 荧光显微镜/激光共聚焦● 载玻片和盖玻片● 纯水● DAPI(100nM)
● PBS ● 4%多聚甲醛● 透化液0.05～0.1% Triton X-100(溶于PBS)
● 盖玻片周围密封液(如透明指甲油)

组份	100T	250T
组份A：C15-Phalloidin染料	100μL	250μL
组份B：染料稀释液	10mL	20mL
说明书	1份	1份

染料-20℃避光保存；稀释液2～8℃保存。有效期6个月。
注：
● 染料2周内可以2～8℃保存。染料长期不用可以-20℃保存。避免反复冻融。
● 染色液A为DMSO溶液，冬季气温较低时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
● 可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。吸头也需要放在培养箱预热，否则容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。


● 螺旋盖微量管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体损失导致试剂量不够用。
● 标本应新鲜，且未受其他化学物品污染。
● 应根据组织、细胞类型不同调整通透时间。
● 动物细胞样本通透剂处理时间很关键，如果处理时间太短，会造成很深的背景颜色，干扰细胞骨架观察；如果处理时间太长，会破坏骨架蛋白使骨架纤维断裂，造成细胞空洞。通透时间应控制10～35分钟。需要根据预实验染色结果确定最佳通透时间。一般预实验起始通透时间植物样本为10分钟，动物细胞样本5分钟。
● 染色液染色时间根据根据预实验结果可以进行调整，颜色过浅可延长染色时间，颜色过深可缩短染色时间。
● 洗片时动作要轻柔，避免将细胞从玻片上洗掉。
● 染色后用水充分洗涤，自然晾干即可，不能用常规的酒精梯度脱水方法。
● 不同样本的操作方法稍有差异，请根据具体样本操作。
● 下面以细胞爬片/涂片样本的染色为例，滴加相应的试剂到玻片上，加样量以覆盖样本即可。如果是植物切片等，也可以在离心管、试管等里面进行洗涤、通透、染色等操作，最后置载玻片上观察即可。


1.染色工作液配制：
根据样本数量，用染料稀释液将C15-Phalloidin荧光染料10倍稀释。
再用相应的无血清培养基或其他缓冲液(如HBSS、PBS等)将荧光染料进行10倍稀释，配制成染色工作液。
注：
● 可不用本盒中的试剂B，用相应培养基/HBSS等缓冲液稀释染料至所需浓度。
● 开始实验前，使用培养基/HBSS缓冲液稀释染料储存液到需要的工作浓度。工作浓度应根据不同细胞的预实验结果确定最佳工作浓度，建议至少在超过10倍范围浓度下进行测试。一般染色终浓度50～150倍稀释，100倍适合大多数细胞样本。
● 工作浓度为根据不同细胞的预实验结果确定的最佳工作浓度。起始测试工作浓度可以用100倍稀释。
● 工作液现配现用。
● 建议收到产品后，根据使用量，对母液进行小量分装，-20℃避光，1年稳定。
2.将制作好的细胞爬片/细胞涂片用37℃预热的1×PBS(pH7.4)清洗2次。
3.细胞固定：滴加溶于PBS的4%甲醛溶液进行细胞固定，室温固定5分钟，立即用PBS洗涤3～5次。
注：
● 避免固定剂中含有甲醇成分，因为甲醇在固定过程中可能破坏肌动蛋白。
● 样本多时可用容器装好PBS分别浸泡洗涤3～5次，样本较少时也可以加500μL PBS到玻片上进行洗涤。
● 此步骤为动物细胞样本的步骤，植物切片类不需要做此步骤，第2步洗涤完直接进行第4步通透即可。
4.室温条件下，透化细胞：滴加0.05～0.1% Triton X-100/PBS溶液透化处理样本，处理3～5分钟。
注：
● 经Triton破膜过度后，C15-Phalloidin可能对细胞核有非特异性染色，注意通透时间。
● 该步骤可以省略，因为C15-Phalloidin分子量比较小，多聚甲醛固定后细胞膜产生的部分孔洞可以让C15-Phalloidin进入细胞。
5.室温条件下，用PBS洗细胞3～5次，自然晾干。
6.室温条件下，染色：用适量细胞骨架染色液工作液，覆盖住玻片上的细胞，室温避光孵育40分钟-更长时间，最长可以过夜染色，一般40分钟～1小时即可。
注：
● 可以在染色工作液内加入终浓度为1% BSA，能起到降低背景的作用；
● 或者在染色前用含1% BSA的PBS液室温封闭细胞20～30分钟。
● 孵育过程中为了避免溶液挥发，可将玻片转移到一个密封的容器内。
7.用PBS洗细胞3次，每次5分钟。自然晾干。
8.使用适量浓度为100nM的DAPI溶液对细胞核进行复染，约30秒即可。
注：
● 此步为选做步骤，可以不进行核复染。也可根据需要选择其它颜色的核染料。
9.用PBS洗细胞。
10.用激光共聚焦显微镜观察。C15-Phalloidin激发/发射波长650/666nm和DAPI激发/发射波长359-364/454～461nm。
注：
● 或封片后观察。
● 标本玻片可置于4℃避光保存，通常6个月内可继续做染色分析。
染色结果：
细胞骨架纤维呈红色。细胞核呈蓝色(如果DAPI复染)。
细胞核和细胞质表面分布许多排列不规则的纤维束，走向清晰。
注：
● 如果见到部分细胞骨架纤维并非呈纤维状，而是呈串珠状或颗粒状，可以进一步优化通透、染色时间、染液浓度等条件。
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